Bioquímica y Bioquímica Analítica

Abstracto

Congreso de Biotecnología 2015: Cisteína modificada químicamente en procesos de lotes alimentados e impacto en la productividad específica de CHO - Aline Zimmer Merck Millipore

Aline Zimmer

El cultivo industrial de células de mamíferos en lotes alimentados se utiliza para la producción de proteínas terapéuticas, como anticuerpos monoclonales. Además de un medio que garantice el crecimiento inicial, es necesario alimentar para mejorar el crecimiento, la viabilidad y la producción de anticuerpos. Los sistemas comerciales establecidos incluyen un alimento principal concentrado ligeramente ácido y un alimento de aminoácidos alcalino separado que contiene L-tirosina y L-cisteína. Dado que la L-cisteína no es estable debido a su dimerización a cisteína en presencia de aire y catalizadores metálicos, se necesita un derivado de L-cisteína estable para incluir todos los aminoácidos en los alimentos de pH neutro. Estos sistemas de alimentación única son los preferidos para simplificar los esquemas de alimentación y mejorar la solidez general del proceso a través de la estabilización de las señales de pH y DO. Aquí, sugerimos el uso de una cisteína modificada químicamente en combinación con sal disódica de tirosina fosforada en un proceso industrial de lotes alimentados con una sola alimentación aplicable a pequeña escala, así como en biorreactores. Los experimentos de cultivo celular se llevaron a cabo en tubos de centrifugación o biorreactores con una línea celular de suspensión de CHO que expresa un anticuerpo monoclonal humano. La densidad y viabilidad de las células viables se midieron utilizando un dispositivo automático de recuento de células. Se realizó un análisis de los sobrenadantes del medio usado para los aminoácidos después de la derivatización precolumna y el análisis UPLC y para las vitaminas utilizando LC-MS/MS.

Las mediciones de metabolitos se realizaron con Cedex Bio HT basándose en métodos fotométricos y turbidométricos. La caracterización del anticuerpo monoclonal se realizó utilizando el marcaje 2-AB para los análisis de glicanos, cIEF para los análisis de variantes de carga y LC-MS/MS para los experimentos de mapeo de péptidos. Los estudios de estabilidad del alimento que contenía el derivado de cisteína modificado mostraron que la molécula era estable y que no se liberó L-cisteína o L-cistina durante tres meses cuando se almacenó a temperatura ambiente o 4 °C. Además, no se observó ningún cambio en el color del alimento con el tiempo. Los experimentos de lotes a pequeña escala donde se reemplazó la L-cisteína por la misma cantidad de cisteína modificada químicamente no indicaron cambios en los perfiles de crecimiento o viabilidad. El uso del derivado de cisteína modificado en procesos de lotes alimentados a pequeña escala indicó una densidad celular viable máxima comparable, viabilidad prolongada y mayor título en comparación con el sistema de dos alimentos establecido.

Bioreactor experiments confirmed the increase in specific productivity described at small scale when the single feed strategy was compared to the two feed strategy. In depth characterization of the monoclonal antibody indicated no change in the glycosylation or charge variant pattern whereas peptide mapping experiments were not able to detect any integration of the modified amino acid in the sequence of the monoclonal antibody. Mammalian took care of clump forms for monoclonal neutralizer (mAb) creation depend on vital taking care of a few supplements, for example, glucose, nutrients and amino acids to expand culture time and improve protein production[1].In real procedures, L-cysteine and L-tyrosine are taken care of independently at soluble pH due their low steadiness and low solvency at impartial pH, bringing about pH tops and precipitations[2]. To improve cutting edge forms, both amino acids have been artificially altered to upgrade their particular solidness and dissolvability profiles. Past work has exhibited that phosphotyrosine disodium salt (PTyr2Na) is a steady L-tyrosine subordinate and can be utilized in unbiased pH takes care of without detectably affecting the way of life execution or the mAb quality attributes[3]. Here, we present outcomes got utilizing a L-cysteine subsidiary in a nonpartisan pH, single-feed framework.

The dependability of the L-cysteine subsidiary was assessed in nonpartisan pH, CellventoTM Feed-220 during a quarter of a year at room temperature or 4°C.For took care of group societies, a CHO K1 clone communicating a human mAb was utilized. Development was acted in the Cellvento™ CHO-220 media framework as indicated by the item procedure direction. For controls, Cellvento™ Feed-220 and a different basic cysteine/tyrosine feed were utilized though in the single feed process, the L-cysteine subsidiary and PTyr2Na were legitimately solubilized in the unbiased pH, primary feed. Trials were acted in turn tubes and 1.2L bioreactors. Development and reasonability were observed utilizing a ViCell®,titer was resolved utilizing Cedex Bio HT and explicit profitability was determined dependent on titer, vital feasible cell thickness and weakening.

For spent media investigation, the L-cysteine subsidiary and amino corrosive measurement was performed by UPLCusing AccQ·TagTMUltra Reagent. To evaluate the responsive capability of the feed, H2DCFDA was added to the nonpartisan pH, Cellvento™ Feed-220 enhanced or not with the subordinate. For intracellular responsive species evaluation, cells were marked with carboxy-H2DCFDA and fluorescence was estimated. To assess the limit of the cells to use the subsidiary, cell lysates were spiked and shaped items were evaluated by UPLC. For mAb examination, N-glycosylation was measured utilizing HPLC after 2-AB marking, while charge variations were resolved utilizing cIEF.

La investigación de la estabilidad de la subunidad L-cisteína en una alimentación de pH neutral no demostró cambios en la fijación de la subunidad ni en la liberación de L-cisteína/L-cistina cuando se almacenó durante más de un cuarto de año a temperatura ambiente o 4°C. No se observó precipitación ni cambio de color, lo que demuestra que la subunidad era estable en las condiciones probadas. El desarrollo controlado del grupo en tubos de ensayo con el procedimiento de alimentación única provocó mayores viabilidades finales que llevaron a títulos finales mejorados en comparación con la condición de control. Los resultados de los tubos de ensayo se confirmaron en biorreactores que llevaron a mayores viabilidades finales, mayores títulos y mayor rentabilidad explícita con la metodología de alimentación única.

Se estimó una oxidación de color más baja después de la expansión de H2DCFDA a pH neutro, Cellvento™ Feed-220 que contiene el derivado en comparación con el derivado solo, que mostró un potencial receptivo más bajo. La oxidación de color intracelular más baja se identificó mediante la expansión de carboxi-H2DCFDA para convertir las sociedades de grupos controlados de alimentación única de tubo que mostraron una edad de especies receptivas intracelulares más baja cuando se utilizó el derivado. En el momento en que se agregó a los lisados ​​celulares, el derivado de cisteína se usó para cisteína. No se reconoció ninguna diferencia en la N-glicosilación o variación de carga en el mAb administrado, lo que demuestra que no hay efecto del derivado en las características de calidad básica introducidas. Este estudio muestra que el derivado de L-cisteína y PTyr2Na se pueden incorporar en un control de pH neutro y se pueden utilizar como una fuente de L-cisteína en formas de grupo controlado, lo que provoca una mayor eficiencia explícita en comparación con el proceso de primera clase sin afectar las propiedades de calidad básica del mAb.