Tecnología genética

Abstracto

Caracterización de dominios proteicos monoméricos que se unen específicamente a un objetivo de ADN de 100 pb altamente conservado dentro de genes de ARNr

Elodie Carnus, Marie-Véronique Demattei, Sophie Casteret, Guillaume Carpentier, Fabien Palazzoli, Solenne Bire, Christophe Bressac e Yves Bigot

Las pruebas de concepto han demostrado que los grupos de genes cromosómicos que codifican el ARN ribosómico (ARNr) constituyen loci de integración de entrega de genes que son óptimos para la expresión de transgenes. Sin embargo, debido a que la recombinación homóloga es eficiente para integrar segmentos de ADN en estos genes en animales, se requieren nuevas herramientas moleculares para construir sistemas capaces de dirigirse a moléculas en la proximidad inmediata de los genes del ARNr.

 Investigamos las propiedades de varios dominios de unión al ADN (DBD) capaces de reconocer específicamente un motivo dentro de una región de 100 pb de los genes del ARNr que está conservada en un 99-100% entre los eucariotas. Nuestros hallazgos demuestran que dos DBD similares a Myb que se originan a partir de las endonucleasas codificadas por retrotransposones R2 no LTR son candidatos prometedores ya que i) reconocen específicamente, con alta afinidad, un sitio de unión de 20 pb ubicado dentro del objetivo genómico del ADNr esperado, ii) actúan como monómeros, iii) contienen una señal de localización nuclear, iv) permanecen funcionales cuando se fusionan a otro dominio y, v) no alteran la funcionalidad de la proteína a la que están fusionados. Sin embargo, los resultados obtenidos in vivo con varias fusiones de R2DBD revelan que quedan dos propiedades por diseñar antes de que estos DBD puedan integrarse en un sistema de orientación molecular dirigido a los genes del ARNr. El primero se refiere a la capacidad de R2DBD para localizarse dentro del nucléolo, el orgánulo en el que residen los genes del ARNr. El segundo es la tendencia de R2DBD a acumularse en ciertas partes de los núcleos, lo que limita su difusión dentro de los núcleos. Se discuten soluciones para sortear estas limitaciones actuales. Nuestros resultados proporcionan información importante sobre las propiedades de R2DBD y la orientación del ADN plasmídico dentro de los núcleos. Será necesario analizarlos más a fondo desde tres aspectos: las ventajas no explotadas de los R2DBD, las posibilidades y limitaciones de los péptidos de fusión para la orientación de integraciones de vectores no virales y las alternativas a los péptidos de fusión para la orientación de vectores.