Revista de trastornos nutricionales y terapia

Abstracto

Nutrición clínica 2019: Los efectos del té de kombucha en la integridad intestinal de los ratones - Elaheh Mahmoudi - Universidad de Ciencias Médicas de Alborz

Elahe Mahmoudi

Objetivo(s): El estrés oxidativo está implicado en la patogénesis de la hiperplasia prostática benigna, un factor de riesgo de morbilidad y mortalidad cardiovascular. Varios estudios en humanos han demostrado que los carotenoides del tomate pueden afectar varios aspectos de la salud humana. Durante esta presentación, el autor abordará dos cuestiones: a) equilibrar la respuesta de las células de la piel a la radiación UV y b) la reducción de los signos vitales elevados. a) Varios estudios en humanos han demostrado que los carotenoides del tomate pueden reducir el daño inducido por los rayos UV al reducir el eritema y mejorar el equilibrio entre la producción y la degradación del colágeno. Planteamos la hipótesis de que una mezcla de carotenoides del tomate junto con polifenoles podría brindar una mejor protección de la piel que la esperada a partir de la suma de sus actividades. Verdaderamente, entendimos que las mezclas de complejo de nutrientes del tomate (que contiene licopeno) con extracto de romero (que contiene el ácido polifenólico carnósico) redujeron sinérgicamente los marcadores inflamatorios e indujeron la actividad antioxidante en las células de la piel, principalmente para disminuir la metaloproteinasa de matriz (MMP) y, por lo tanto, pueden disminuir la degradación del colágeno y retrasar el envejecimiento de la piel. b) La hiperplasia prostática benigna puede ser un factor de riesgo de morbilidad y mortalidad cardiovascular. Realizamos un análisis de dosis-respuesta para descubrir la dosis eficaz óptima de un suplemento de complejo de nutrientes de tomate para mantener signos normales en individuos hipertensos. Materiales y métodos:

Se persuadió el intestino tipo tamiz en dos grupos de ratones jóvenes y adultos utilizando sulfato de sodio de dextrano en bebida durante siete días. Anteriormente, se administró fKT a los ratones con colitis y se comparó con animales normales y no tratados de la misma edad con colitis.

Preparación del té Kombucha (KT)

Se añadió té negro (Golestán, Teherán, Irán) a agua hirviendo (1,2 % p/v), se mezcló y se dejó reposar durante 10 min. Luego, el té se filtró a través de un tamiz estéril y se disolvió sacarosa (10 %) en el té. Para organizar el KT, se inocularon 200 ml del té enfriado con 3 % p/v de hongo del té más 10 % v/v de líquido KT que se había fermentado previamente. Luego, la recolección se dejó fermentar incubándola a 28 °C durante 14 días. Para formar KT filtrado (fKT), el té fermentado resultante se centrifugó a 5000 rpm durante 20 min y se filtró empleando un filtro de celulosa de 0,45 µm equipado con una bomba de aire.

Grupos experimentales y diseño del estudio

Male NMR mice were purchased from the Pasteur Institute Experimental Animal Center, Tehran, Iran. All animals were housed for one week before the experiments began in light- and temperature-regulated rooms at the traditional animal department of Alborz University of Medical Sciences.  All experimentations were permitted by the native ethical group (reference No Abzums.Rec.1395.51) and performed consistent with Animal Care and Use Protocol of Alborz University of Medical Sciences.

The animals were divided into two groups of young and old. Each group was then further subdivided into two groups (8 in each) including normal and colitis-induced. because the figure indicates, each of colitis-induced old or young groups was further subdivided into two subgroups, including colitis-induced with no treatment and colitis-induced treated with fKT. The study was performed in three phases. within the initiative , DSS-induced colitis was found out in young (2 months) and old (16 months) mice during a period of 21 days during which weight loss and therefore the clinical score were evaluated and compared with the age-matched healthy animals. within the second phase, the effect of fKT administration on survival analysis and therefore the clinical score were evaluated during a period of 21 days. After completion of phase I clinical trial and II of the study, molecular and histological evaluations were performed on young and old healthy controls, DSS-induced colitis, and DSS-induced colitis treated with fKT animals in phase III clinical trial . Considering the deathrate and clinical signs that occurred within the animals with colitis, animals at this phase of the study were sacrificed on day 14 after the start of the study.

Colitis induction

Colitis was induced on day 0 using administration of drinking water containing 3.5% (w/v) dextran sodium sulfate salt (DSS) (40000 kDa, MP Biomedical, Eschwege, Germany) per mouse per day. The animals and clinical signs of disease were daily monitored, indicated by weight loss, occurrence of blood in the stool or around the rectum, and diarrhea until day seven after the colitis induction. Weight loss was determined by comparing the body weight for each mouse to the baseline body weight and expressed as a percentage of weight loss. Other symptoms were scored according to the previously suggested system by Siegmund et al. Briefly, the different signs for stool consistency were scored as follows: score 0, well-formed pellets; score 2, pasty and semi-formed stools that did not adhere to the anus; score 4, liquid stools that did adhere to the anus. The different signs for bleeding were scored as follows: score 0, no blood measured using the Hemoccult system (Beckman Coulter); score 2, positive Hemoccult; score 4, gross bleeding. Animals with borderline scores were given a one-half score.

Histological and histopathological analysis

To perform histological evaluation of the colon, the animals were sacrificed under ether anesthesia after the last treatment with beverage or fKT. Colon was initially flushed with 1x ice-cold phosphate buffered saline (PBS) to get rid of feces completely. Tissue samples of the colon were then removed, fixed in 10% buffered formalin, and processed for paraffin sectioning. Sections of about 5 μm thickness were taken and stained with Hematoxylin and Eosin (H&E). The stained sections were examined with an Olympus cX41 microscope and photographed using an Olympus D330 camera . Damage score ranged from 0 to 4 scale was judged based on: inflammation represented by number and extent of leukocyte infiltration, epithelial defects represented by the severity of injury to the somatic cell layer, crypt atrophy estimated visually for the percent of atrophy within the crypts, edema, polymorphonuclear cells(PMNs) infiltration, and mucosal disruption.

Immunofluorescence studies of ZO-1 and ZO-2 expression

Sections of 5 µm paraffin-embedded colon tissues were prepared from each sample and then dewaxed, hydrated, and incubated in a protein block solution. Subsequently, the sections were incubated with the primary rabbit monoclonal ZO-1 or ZO-2 antibody (diluted 1:100 in 0.01 mol /L PBS; Zo-1: ab214228, Zo-2: ab2273, UK) followed by incubation with a goat anti-rabbit Alexa flour 488 (ab150077, Abcam, Cambridge shire, UK). The images were captured using a DeltaPix fluorescent microscope (Smorum, Denmark) and evaluated independently by two expert pathologists.

Analysis of gene expression by real-time PCR

Total RNA was extracted from ~50 mg of frozen colon tissue using guanidine/phenol solution (reagent lysis Qiazol-USA) consistent with the manufacturer’s instruction. the standard and quantity of RNA concentrations were monitored employing a NanoDrop 2000c (Eppendorf, Germany). Then, 1 μg RNA was reversely transcribed to DNA using Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (Munich, Germany), consistent with the manufacturer’s instructions. The relative expression of mRNA for GAPDH, ZO-1, and ZO-2 decided by preparing reaction mixer with PCR Master Mix (2X) (Amplicon-Denmark) and gene-specific primers with diluted cDNA and final volume made up to 10 μl with nuclease-free water. Quantification and analysis were administered in ABI real-time PCR. The sequences of primers, designed by Integrated DNA Technologies, were forward 5′-TGTCCCACTTGAATCCCC-3′ and reverse 5′-TGTTTCCTCCATTGCTGTG-3′ for ZO-1 and forward 5′-CTCCCTCTTCACATCTGCTTC-3′ and reverse R: 5′-CTGTTACTTGCTTTGGTCTGG-3′ for ZO-2. The efficiencies for primers utilized in the study varied between 95% and 105%. Primer pairs were validated to make sure the right size of the PCR product and therefore the absence of primer dimers. The GAPDH gene was chosen as an indoor control against which mRNA expression of the target gene was normalized. The resultant organic phenomenon level was presented as 2-ΔCt, during which ΔCt was the difference between Ct values of the target gene and GAPDH.

Statistical analysis

Statistical analysis was performed using Graph Pad Prism 7.01. Data are presented as means± SD. ANOVA was wont to indicate any significant difference between the groups. Survival rates were illustrated using Kaplan–Meier plots and compared using the log-rank test. Value of P was considered statistically significant when it had been but 0.05.

Results:

Characteristics and clinical course of DSS-induced colitis

La colitis inducida por DSS en ratones es el modelo animal más utilizado para tratar la patogenia de la colitis y evaluar los enfoques terapéuticos. Este modelo se descubrió en nuestro laboratorio y se controló durante un período de 21 días (fase I). Para ello, se administró a ratones NMR machos un 3,5 % de DSS en bebida durante siete días. Se controló a los animales diariamente durante el período del estudio para determinar la tasa de supervivencia, la pérdida de peso y los signos clínicos de colitis, incluidos el sangrado y la diarrea, y se los comparó con animales sanos de la misma edad. El análisis de supervivencia de los animales jóvenes tratados con DSS demostró que el 66% y el 33% de los animales estaban vivos los días 7 y 14, respectivamente, y todos estaban muertos el día 2. En el caso de los animales viejos tratados con DSS, el análisis de supervivencia reveló que el 66% y el 50% de los animales estaban vivos los días 7 y 14, respectivamente, y todos estaban muertos el día 21. Hubo una gran pérdida de peso dentro de los grupos jóvenes y viejos tratados con DSS en comparación con los animales sanos de la misma edad. Los ratones jóvenes tratados con DSS habían perdido aproximadamente el 10% y el 46% de su peso los días 7 y 14, respectivamente. Los ratones viejos tratados con DSS habían perdido aproximadamente el 13,5% y el 15% de su peso los días 7 y 14, respectivamente. En cuanto a los signos de trastornos digestivos, se observaron sangrado y diarrea en ratones jóvenes y viejos tratados con DSS el día 2 y tres después de la administración de DSS, respectivamente. Estos resultados demuestran que los ratones jóvenes tratados con DSS muestran signos clínicos más graves y una tasa de supervivencia menor que los ratones viejos tratados con DSS.

Observaciones histológicas

El análisis histológico de las secciones de tejido teñidas con H&E (Figura 6) de todos los ratones jóvenes y viejos desafiados con DSS mostró una mayor infiltración de PMN, pérdida críptica, defecto epitelial, alteración de la mucosa, apoptosis, edema y adelgazamiento de la mucosa en comparación con los ratones sanos de la misma edad. El tratamiento con fKT disminuyó la extensión de la lesión, aunque no causó una reversión completa al estado saludable por el régimen administrado durante este estudio. En particular, los ratones viejos sanos tuvieron más infiltración de PMN, pérdida críptica y edema que los animales jóvenes y sanos. Como se muestra en la Figura 6c, el grosor de la mucosa disminuyó con la administración de DSS porque la puntuación clínica aumentó tanto en los ratones jóvenes como en los viejos con colitis inducida por DSS. Este trabajo se presenta parcialmente en la ^24ª Conferencia  Internacional sobre Nutrición Clínica , celebrada del 4 al 6 de marzo de 2019 en Barcelona, ​​España.