Revista global de biología, agricultura y ciencias de la salud

Abstracto

Diseño, optimización y validación de un ensayo de citometría de flujo para la cuantificación de Igg-anti-D (rho) en el control del proceso industrial de producción de globulina anti-rho-gamma

Sergio A Oviedo, Susana Vitali, Jorge Zarzur

Una de las principales causas de la enfermedad hemolítica del recién nacido se debe a la generación de anticuerpos anti-D, en respuesta a un reto antigénico continuo en madres gestantes que no poseen el antígeno D en sus glóbulos rojos. Con el fin de prevenir complicaciones, se realiza el monitoreo de los niveles de anticuerpos anti-D en las gestantes y se previene la sensibilización mediante profilaxis con inmunoglobulina anti-D (IgG anti-D). A la fecha, el monitoreo y titulación de anti-D en plasma y productos terminados (IgG anti-D) se realiza mediante análisis de flujo continuo con un Autoanalizador Technicon, Radio Inmunoensayo (RIA) y Enzimo Inmunoensayo (EIA). En nuestro laboratorio, para la cuantificación de anticuerpos anti-D de la Gamma-Rho UNC y de los productos del proceso de elaboración, se desarrolló una técnica “casera” de citometría de flujo como prueba alternativa al método de referencia de la Farmacopea Europea. Se utilizaron anticuerpos policlonales anti-Rho y un IgG humano marcado con anti FITC (isotiocianato de fluoresceína) para medir la concentración de anticuerpos anti-D en una preparación comercial de gammaglobulina, plasma humano y semiprocesado. El método fue desarrollado utilizando el 1er estándar internacional de la OMS para IgG anti-D (69/419). A la concentración de glóbulos rojos utilizada en el método (5 x 104 células/ul) no hay interferencia por autoaglutinación. La curva dosis respuesta obtenida (MFI vs. Log C) fue lineal en el rango de trabajo adoptado, presentando un coeficiente de correlación de 0,99. Las pruebas de especificidad y recuperación fueron satisfactorias, los controles negativos mostraron niveles insignificantes de fluorescencia y no presentaron una interferencia grave en la determinación. Sabiendo que los niveles de antígenos anti-D por glóbulo rojo, varían de acuerdo al fenotipo, nuestros resultados muestran que los glóbulos con fenotipos R1R1 presentan el mejor desempeño para esta prueba, y pueden ser reemplazados si es necesario por células R1R2. El método fue validado siguiendo los criterios del grupo de Expertos N°6B del NIBSC y la Farmacopea Europea quienes han estandarizado un procedimiento similar para ser aplicado en la evaluación de anti-D. La Citometría de Flujo permitió obtener determinaciones exactas, precisas, sensibles y específicas a diferentes concentraciones de anti-D (100-0.9 ug/ml) y en diferentes matrices biológicas como producto terminado, producto concentrado prellenado y fracción II del método de Cohn. Las ventajas encontradas en la aplicación de este método, además del costo relativamente bajo, incluyen una fuerte señal de fluorescencia que no requiere amplificación, el uso de muestras altamente diluidas que minimizan el riesgo de aglutinación por IgM-Anti D o polímeros. Es un método simple, rápido y confiable para determinar los niveles séricos de anti-D o cuantificar la concentración en una solución de inmunoglobulina.