Revista de Bacteriología y Parasitología

Abstracto

Genotipado y análisis filogenético del VHB mediante PCR multiplex utilizando pares de cebadores específicos de tipo en la población pakistaní

Javed Iqbal, Abida Raza y Jabar Zaman Khan Khattak

Antecedentes: El virus de la hepatitis B, que causa carcinoma hepatocelular agudo y crónico, sigue siendo un problema de salud grave que afecta a más de 350 millones de personas en todo el mundo. Geográficamente, hasta el momento se han identificado nueve genotipos del VHB. Cuatro marcos de lectura abiertos denominados (ORF P, S, F y X) lo dirigen específicamente a las células de los hepatocitos. Además, el proceso de transcripción inversa presente en el ciclo de vida del VHB provocó tasas de mutación cuatro veces más altas en comparación con el adenovirus. Las diferencias estructurales y funcionales entre los genotipos del VHB son la base de la gravedad, las complicaciones, el tratamiento y, posiblemente, la vacunación contra el virus. La genotipificación de la hepatitis B es importante para evaluar sus implicaciones clínicas y su distribución geográfica, pero los subgenotipos han resultado útiles para la determinación de marcadores genómicos específicos relacionados con la hepatocarcinogénesis y las terapias médicas. En Pakistán, no hay datos disponibles sobre el análisis evolutivo molecular del VHB. Por lo tanto, era muy necesario un estudio para evaluar los espectros de las cepas dominantes que prevalecen aquí.

Objetivos: Este estudio tuvo como objetivo determinar la prevalencia de genotipos de VHB entre la población de Pakistán. En esta investigación, nos centramos en descubrir las nuevas cepas y subgenotipos de VHB. Pakistán es uno de los países endémicos de VHB, pero no hay datos sobre los subgenotipos y su recombinación o la relación filogenética del virus endémico en el país. El presente estudio se llevó a cabo en esta perspectiva. Este estudio ayudará a los futuros investigadores a estudiar algunos otros aspectos de las cepas relacionadas con el VHB en Pakistán y también sobre sus terapias médicas.

Lugar y duración del estudio: El presente estudio se llevó a cabo en el laboratorio de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), Instituto de Medicina Nuclear, Oncología y Radioterapia [NORI], Islamabad, y las muestras se recolectaron entre septiembre de 2012 y febrero de 2014.

Diseño del estudio: Se recogieron un total de 450 muestras positivas de antígeno de superficie de hepatitis B HBsAg y ADN de VHB en el primer paso durante el período de septiembre de 2012 a febrero de 2014 y se enviaron al Instituto de Medicina Nuclear, Oncología y Radioterapia [NORI], para su posterior análisis. Todas las muestras fueron genotipadas mediante el método de pares de cebadores de PCR anidados específicos de tipo para 8 genotipos de VHB de A a H. Los pacientes fueron seleccionados al azar independientemente de su edad y sexo y se obtuvo un consentimiento por escrito (consentimiento de los padres en caso de ser menores de 18 años). El estudio fue aprobado por el comité de revisión ética. En nuestra investigación, hemos utilizado la técnica de cebadores específicos de tipo para averiguar la cepa dominante en las poblaciones paquistaníes y, además, su análisis filogenético con secuencias de referencia recuperadas de las bases de datos del NCBI.

Resultados: Nuestros resultados mostraron una relación directa entre la carga viral y los genotipos identificados y señalaron que el genotipo D es el genotipo más predominante y prevalece en altas proporciones entre todos los genotipos en la población pakistaní. Las infecciones mixtas de genotipo VHB de genotipo A con B y C, D con B y C constituyen alrededor del 17 por ciento de todas las muestras. Se han identificado subgenotipos de diferentes cepas de VHB sobre la base de diferencias en las secuencias de nucleótidos completas. Los resultados positivos de PCR se repitieron dos veces para confirmación. Además, el análisis filogenético reveló una homología entre nuestras secuencias informadas y las secuencias de referencia. El método filogenético mostró que los genotipos/subgenotipos varían en las áreas geográficas y se correlacionan fuertemente con la etnia.

Conclusión: Se identificó el genotipo D y resultó ser el genotipo más dominante en la comunidad pakistaní, mostrando subgenotipos de D1 y D3 en nuestro estudio. Los genotipos A y D están presentes como coinfección entre sí y contribuyeron como el segundo grupo genotípico predominante. Además, el análisis filogenético reveló que los genotipos varían en las áreas geográficas y se correlacionan fuertemente con las secuencias de referencia del NCBI.