Tecnología genética

Abstracto

Expresión de proinsulina humana recombinante en E. coli mediante la alteración de la región traducida y no traducida de 5ʹ

Aslam F, Latif K, Waseem R, Naz S y Iftikhar S

El ARN mensajero inicia el proceso de traducción al transferir el código de ADN al ARN de transferencia. Una secuencia rica en polipurinas llamada secuencia Shine-Dalgarno ayuda a determinar la posición del codón de inicio; la secuencia Shine-Dalgarno es diferente porque permite que el ribosoma se construya en una posición interior del ARNm mediante la unión directa a esta secuencia. El sitio de unión ribosomal en el extremo 5' del sitio de inicio de la traducción se utiliza para unir la estructura secundaria del ARNm; la distancia entre el RBS y el codón de inicio afecta la eficiencia de la traducción de un gen. En este estudio, cambiamos la distancia entre el sitio de unión del ribosoma y el codón de inicio para obtener diferentes proporciones de expresión de la traducción. Para este propósito, el gen de proinsulina clonado en el vector pET21a, la distancia entre el sitio de unión y el codón de inicio se ha mantenido en 8 nucleótidos. A esta distancia entre el sitio de unión del ribosoma (RBS) y el codón de inicio, la expresión de proinsulina fue del 30% de las proteínas celulares totales. Cuando hay 10 nucleótidos entre ellos, la expresión disminuyó hasta un 2-4%. Con 12 nucleótidos entre RBS y el codón de inicio, la expresión disminuyó aún más hasta un 1-2%. Como estos intentos se hacen al azar, al verificar las estructuras secundarias del ARNm por M-fold se mostró una unión entre el sitio de unión del ribosoma y el inicio del gen de proinsulina. Se realizó otro intento incorporando diez nucleótidos diferentes al inicio del gen de proinsulina para hacer que la estructura secundaria del ARNm sea menos estable (ΔG = -5,5) no altera significativamente la expresión de proinsulina en células con codón BL21 plus. Existen otros factores que controlan la expresión de proteínas, es decir, la inestabilidad metabólica, la degradación rápida del ARNm o la acumulación de proteínas pueden regular a la baja la expresión del ARNm.