Bioquímica y Bioquímica Analítica

Abstracto

El uso de diclorofluoresceína como sonda para monitorear los efectos del calcio en la producción de ROS en las mitocondrias

Olga V Akopova, Liudmila Kolchinskaya y Valentina Nosar

La diclorofluoresceína (DCF) se utiliza ampliamente para controlar la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) en células y mitocondrias aisladas. Nuestro objetivo fue comparar diferentes enfoques para el uso de DCF para controlar la formación de ROS que acompaña al transporte de Ca2+ en mitocondrias aisladas. Los efectos del Ca2+ en la producción de ROS se estudiaron en mitocondrias de cerebro e hígado de rata utilizando dos modos de aplicación de DCF: el primero fue la precarga de la suspensión mitocondrial de reserva con el precursor de DCF, diacetato de diclorofluoresceína (DCFDA), y el otro fue la adición de las alícuotas de DCFDA directamente al medio de incubación. El calcio aumentó la producción de ROS en mitocondrias de cerebro y hígado tanto en condiciones de estado estable como de no equilibrio causado por la liberación gradual de citocromo c y la regulación del flujo de electrones. Utilizando mitocondrias precargadas con DCF hemos demostrado que la tasa de formación de ROS en condiciones de estado estable dependía linealmente de la tasa de ciclado de Ca2+ y de la respiración estimulada por Ca2+. La transición al estado de no equilibrio resultó en un aumento no lineal en la formación de ROS, que también exhibió dependencia de la concentración de Ca2+. Mientras que en las mitocondrias precargadas con DCF la fluorescencia del DCF siguió de cerca la evolución temporal del transporte de Ca2+, en las mitocondrias sin carga la carga de la sonda interfirió en la detección de la formación de ROS debido al cambio continuo de la concentración de DCF en el espacio de la matriz. Con base en los experimentos, llegamos a la conclusión de que el DCF precargado en las mitocondrias podría servir como una sonda adecuada para monitorear los efectos del transporte de Ca2+ en la producción de ROS.