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Abstracto
Uso del modelo celular E18 para cuantificar el efecto espectador asociado a la rotura de la cadena de ADN (DSB-ABE)
Jalal Nasir
La línea celular de linfoblastos E18 es un derivado de TK6 y tiene un inserto I-Sce1 en el intrón 2 del gen heterocigoto TK1 / tk1 . E18 puede ser atacada con la endonucleasa de restricción I-Sce1 para inducir roturas de doble cadena en el sitio I-Sce1 para medir el daño al ADN independiente de la radiación y el efecto espectador asociado. Para la construcción de la línea celular E18, se insertó un sitio Eco47III en la estructura principal del plásmido linealizado pTK-UAS y se hibridó con oligonucleótidos de extremos romos de la secuencia de restricción ISce1 en presencia de ADN ligasa. Las células DH5-α se transformaron transfectando térmicamente las células con pTK-UAS-Eco47III-Sce1 y seleccionando colonias resistentes a la ampicilina. Se extrajo el ADN plasmídico y se analizó para detectar la presencia de sitios Eco47III e I-Sce1. Se seleccionó un clon con el sitio I-Sce en el intrón 2 del alelo activo de la timidina quinasa para una mayor experimentación y se lo denominó E18. Este modelo se probó para demostrar las mutaciones inducidas por la rotura de doble cadena y estas roturas de cadena también pueden producir un efecto espectador asociado a la rotura de la cadena de ADN (DSB-ABE), medido por el aumento de la frecuencia de mutación en células ingenuas. El plásmido pAdTrackCMV I-Sce1 que lleva el marcador GFP se electroporó en células E18 para expresar la endonucleasa de restricción I-Sce1 que se dirige específicamente al sitio I-Sce1 en el intrón 2 del alelo activo TK. Se empleó un ensayo de fracción de mutación para medir la fracción de mutación directa (DMF) o acompañado de una transferencia de medio condicionado a células ingenuas para medir la fracción de mutación espectadora (BMF) como punto final de la selección de E18 con una expresión exógena de I-Sce1 a través de pAdTrackCMV I-Sce1 para inducir daño al ADN y cuantificar DMF y BMF.