Pharmaceutica Analytica Acta

Abstracto

Desarrollo de un ensayo rápido y rentable para la detección de la inhibición reversible del citocromo P450 en paralelo con la inhibición dependiente del metabolismo de Cyp3a4 utilizando proteínas recombinantes

Serenella Zambon, Stefano Fontana, Raffaele Longhi y Mahmud Kajbaf

En el presente estudio hemos desarrollado un ensayo de inhibición de CYP450 de alta calidad, rápido y rentable que tiene la capacidad de detectar tanto la inhibición reversible como la inhibición dependiente del metabolismo de CYP3A4 (MDI), utilizando isoformas de P450 expresadas de forma recombinante y sustratos de P450 fluorogénicos. La isoforma de CYP3A4 se analiza con dietoxifluoresceína (DEF) como sustrato de prueba. A continuación, se pueden calcular los valores de CI50 para los compuestos de prueba frente a la isoforma de CYP3A4, en función de la tasa de metabolismo del sustrato de prueba, medida durante 10 minutos. Además, el potencial inhibidor dependiente del metabolismo de CYP3A4 de los compuestos de prueba se determina ampliando durante 30 minutos la determinación de la tasa de metabolismo de la dietoxifluoresceína y calculando los valores de CI50 cada 5 minutos del período de incubación. Se puede determinar una estimación del potencial inhibidor dependiente del metabolismo de CYP3A4 de los compuestos de prueba comparando los valores de IC50, medidos después de 10 y 30 minutos de incubación. La incubación se realizó utilizando los inhibidores selectivos de CYP miconazol, para la inhibición directa de P450, y troleandromicina, para la inhibición dependiente del metabolismo, como controles positivos. Todo el proceso de selección se automatizó completamente en formato de placa de 96 pocillos con el uso de la tecnología robótica de manipulación de líquidos de Hamilton acoplada a dos fluorímetros (Tecan) y una gestión de información de laboratorio personalizada. Este ensayo se aplica actualmente para seleccionar compuestos en las primeras etapas del proceso de optimización de los productos principales e identificar aquellos compuestos que causan una inhibición reversible y/o basada en el metabolismo de CYP450 y, por lo tanto, hacer progresar aquellas moléculas o series químicas con el potencial de DDI más bajo posible. La gran cantidad de datos generados a través de este ensayo también se puede utilizar para crear una base de datos informativa y mejorar los modelos predictivos.