Bioquímica y Bioquímica Analítica

Abstracto

Depuración de heparina por los receptores depuradores del hígado

Edward N. Harris

La gama de tecnologías de ensayo para la unión y señalización se ha desarrollado en los laboratorios de HTS para la identificación de compuestos de referencia o de éxito que actúan sobre los GPCR. El ensayo de unión de [35S] GTPγS sigue siendo una técnica útil y sencilla para demostrar la activación del receptor y es uno de los pocos ensayos funcionales sin células. Sin embargo, su naturaleza radiactiva impone claras limitaciones a su uso en la práctica de laboratorio habitual y en experimentos de alto rendimiento. En este trabajo, hemos desarrollado una nueva versión no radiactiva del ensayo utilizando un análogo de GTP marcado con europio en el que la unión de europio-GTP se puede ensayar utilizando fluorescencia resuelta en el tiempo. Continuando con nuestros esfuerzos, este ensayo se adaptó para los receptores de histamina 3. El formato del ensayo se evaluó específicamente probando fármacos agonistas de histamina 3 conocidos (Imetit, Immepip, Metilhistamina, Proxifan e Histamina) y antagonistas (GSK189254, Clobenpropit y Tioperamida). En condiciones de ensayo optimizadas, las potencias (pEC50 y PKB) en el ensayo de unión concuerdan bien con las obtenidas previamente en el ensayo de actividad funcional isotópica. Se observó que el ensayo de unión Eu-GTP era muy robusto (factor Z' 0,84) con un alto porcentaje sobre los recuentos basales. Este ensayo se puede utilizar como un componente de la cascada de detección para la detección de antagonistas del receptor de histamina 3.