Revista de investigación y terapia con células madre

Abstracto

Microdisección por captura láser de células interzonales murinas: selección de capas y predicción del rendimiento de ARN

Florien Jenner, Gerjo JVM van Osch, Mairead Cleary, Iris Ribitsch, Ulrich Sauer, René van Weeren y Pieter Brama

Objetivo: Los condrocitos articulares se originan a partir de una cohorte distinta de células progenitoras ubicadas en la denominada interzona en las articulaciones en desarrollo embrionario. Realizamos este estudio 1) para determinar si es posible identificar las capas interzonales intermedia y externa histológicamente (usando violeta de cresilo) sin hibridación in situ adjunta o inmunohistoquímica; 2) para establecer si se pueden recolectar cantidades suficientes de ARN de cada capa interzona de embriones individuales para permitir el análisis de la expresión génica; 3) para desarrollar mediciones que puedan proporcionar una estimación del rendimiento de ARN antes de los costosos pasos de amplificación. Métodos: Se recolectaron células de la interzona externa (OI) e intermedia (II) de la articulación femorotibial naciente y del cartílago epifisario (EC) del fémur y la tibia de embriones murinos de 13,5 y 15,5 días de gestación mediante microdisección por captura láser (LCM). Posteriormente, se realizó un análisis de microarrays para confirmar la selección de la capa adecuada. Se midió el área superficial cosechada y el valor de gris (gv) de las fotomicrografías tomadas durante LCM y se calculó la densidad óptica relativa (ROD) correspondiente y se determinaron el grado y la significancia de la correlación con el rendimiento de ARN. Resultados: Las células de OI, II y EC pudieron identificarse histológicamente utilizando tinción con violeta de cresilo y se cosecharon con éxito con LCM produciendo cantidades suficientes de ARN para la amplificación lineal y el análisis de microarrays. El rendimiento de ARN se correlacionó significativamente con el área superficial del tejido cosechado, el gv medio y el ROD correspondiente. Conclusiones: Este estudio proporciona una técnica para la microdisección selectiva por captura láser y el posterior análisis de microarrays de células interzonales murinas de la capa intermedia y externa y presenta un método para estimar el rendimiento de ARN midiendo el área de tejido cosechado y calculando el ROD. Recomendamos cosechar un mínimo de 1×106 μm2 de embriones murinos de 13,5 días y 3×106 μm2 de embriones murinos de 15,5 días para obtener aproximadamente 10 ng de ARN total que se puede utilizar para la amplificación lineal basada en T7 y el posterior análisis de microarrays.