Revista de investigación y terapia con células madre

Abstracto

Cuantificación de progenitores megacariocíticos en productos de aféresis mediante citometría de flujo y PCR en tiempo real

Leinøe Eva, Nielsen Kaspar R, Baech John, Steffensen Rudi, Dybkaer Karen, Boegsted Martin y Johnsen Hans E

Antecedentes y objetivos: La evaluación de la calidad del trasplante autólogo de células madre de sangre periférica (PBSCT) puede mejorarse mediante la enumeración de progenitores megacariocíticos CD34+/CD61+ dentro del injerto. La enumeración de subconjuntos por citometría de flujo (CF) ha sido difícil de estandarizar debido a una baja especificidad que puede surgir de la adherencia de plaquetas o microesferas. Nuestro objetivo fue analizar la adherencia de plaquetas a células madre hematopoyéticas y establecer un ensayo cuantitativo de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-qPCR) para las transcripciones de los genes CD34 y CD61. El análisis se utilizó para estudiar CD34 y CD61 como predictores de la recuperación tardía de plaquetas después del PBSCT en el linfoma no Hodgkin (NHL). Material y métodos: El análisis de CF se realizó en productos de aféresis recolectados para trasplante autólogo y se aplicó microscopía confocal en células clasificadas. La evaluación clínica incluyó el análisis de los productos de leucocitaféresis de 21 pacientes consecutivos con NHL tratados con terapia de dosis alta y PBSCT. La recuperación temprana se definió como un recuento de plaquetas observado >20x10(9)/L antes del día 12 después del trasplante y la recuperación tardía como un recuento de plaquetas observado <20x10(9)/L después del día 12 después del trasplante. Para el análisis RT-qPCR, las células CD34+ se clasificaron de los productos de leucocitaféresis descongelados y se extrajo el ARN y se transcribió de forma inversa a ADNc para un análisis posterior de los niveles de ARNm de CD34 y CD61 utilizando sondas TaqMan. Resultados: Se demostró que las células CD34+/CD61+ identificadas por FC forman un subconjunto específico, sin signos de plaquetas maduras adherentes. Las células CD34+/CD61+ expresaron transcripciones de ARNm de CD61 que no se encontraron en las células CD34+/CD61- complementarias. No se identificó una correlación positiva entre la enumeración basada en FC y la estimación del análisis RT-qPCR de los subconjuntos de progenitores megacariocíticos . La evaluación del impacto clínico mediante la comparación de muestras de 21 pacientes con recuperación plaquetaria temprana y tardía no reveló ningún impacto predictivo para CD61/BACT (β-actina), CD34/BACT o CD61/CD34 mRNA, relaciones de expresión entre células clasificadas CD34+. Conclusión y perspectiva: Un subconjunto específico de células CD34+/CD61+ puede identificarse mediante análisis FC y RTqPCR; sin embargo, la enumeración de este subconjunto no se correlacionó con la recuperación plaquetaria después de PBSCT. Estudios futuros del valor predictivo deben evaluarse en un grupo de pacientes con falla del injerto en colaboración internacional dentro del Grupo Europeo de Trasplante de Sangre y Médula Ósea (EBMT).