Revista de Patología Vegetal y Microbiología

Abstracto

Detección específica de Klebsiella variicola y K. oxytoca mediante amplificación isotérmica mediada por bucle

Jarred Yasuhara-Bell, Caleb Ayin, April Hatada, Yonghoon Yoo, Robert L. Schlub y Anne M. Alvarez

Las especies de Klebsiella son patógenos oportunistas con aislamientos clínicos, veterinarios y asociados a plantas. Un estudio previo mostró que el exudado bacteriano de la madera húmeda de árboles de palo fierro severamente decaídos en Guam contenía Ralstonia solanacearum , Klebsiella variicola y K. oxytoca. En este estudio, la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) detectó específicamente K. variicola y K. oxytoca, utilizando conjuntos de cebadores únicos diseñados individualmente para cada organismo. Cada LAMP detectó su objetivo específicamente, mientras que mostró resultados negativos para bacterias no objetivo y controles negativos. LAMP detectó Klebsiella en tejidos de tallos de palo fierro inoculados y exudado bacteriano. Debido a la presencia de inhibidores de plantas, se probaron diferentes protocolos de muestreo. Remojar muestras de tejido vegetal para permitir la difusión de bacterias en solución, seguido de hervir, proporcionó una detección óptima de Klebsiella directamente de muestras de plantas. Los falsos negativos obtenidos al utilizar muestras de plantas trituradas se eliminaron mediante la inclusión de un paso de enriquecimiento, que implicaba siembra e incubación durante 12 horas. La DGGE (electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante) y un inmunoensayo de transferencia de colonias utilizando un anticuerpo específico de Klebsiella también detectaron Klebsiella en el palo de hierro inoculado. Las bandas de DGGE y las reacciones cruzadas de anticuerpos de enterobacterias estrechamente relacionadas mostraron el potencial de resultados falsos positivos. La naturaleza de LAMP lo hace ideal para las pruebas en el punto de atención y, cuando se combina con la especificidad de los cebadores LAMP desarrollados en este estudio, demuestra su potencial como prueba de campo de rutina para Klebsiella en el palo de hierro en Guam, así como para el diagnóstico clínico y veterinario de la infección por Klebsiella. Además, las regiones seleccionadas para la detección en este estudio tienen aplicación en todas las formas de diagnósticos basados ​​en moléculas.