Revista de tecnología microbiana y bioquímica

Abstracto

Efectos de los pretratamientos en la detección de bacterias mediante PCR cuantitativa: bacterias indicadoras, Enterococcus como modelo

Shin Giek Goh y Karina Yew-Hoong Gin

Las directrices actuales para aguas recreativas (por ejemplo, la USEPA y la OMS) recomiendan los enterococos como indicador tanto para aguas dulces como marinas. El método basado en cultivos se ha utilizado durante décadas para cuantificar la presencia de enterococos. En el año 2012, las directrices de la USEPA para aguas recreativas incluyeron la qPCR como método alternativo para detectar enterococos. El método qPCR no requiere un largo tiempo de incubación como el método basado en cultivos. Además, ofrece las ventajas de una alta especificidad y sensibilidad de detección. Sin embargo, la qPCR se ve obstaculizada por tres factores limitantes principales. Hay células diana limitadas en un pequeño volumen de muestra que se analiza mediante qPCR, la presencia de inhibidores que pueden afectar fácilmente la detección sensible de la qPCR y la persistencia de ADN libre (ADN liberado de células muertas) que causó la señal falsa positiva en la qPCR. Como tal, los tratamientos previos son cruciales para la precisión de la detección de la qPCR. Tres métodos diferentes de preconcentración (i) filtración con membrana de nailon; (ii) filtración con membrana de policarbonato y (ii) centrifugación, se examinaron para su tasa de recuperación. Se encontró que la filtración con membrana de policarbonato brindaba una mayor eficiencia de recuperación y resultados consistentes independientemente de las matrices de muestra. La extracción de ADN convencional y dos kits de extracción de ADN disponibles comercialmente se evaluaron de acuerdo con la pureza del ADN extraído y la eficiencia de recuperación relativa de la extracción. Los resultados muestran que el kit comercial, QIAamp® DNA Mini Kit (Qiagen), brindó el mejor rendimiento. Se demostró que la aplicación de membranas de sílice en QIAamp® DNA Mini Kit mejora la recuperación de ADN con una interferencia mínima de inhibidores. Se evaluaron la monoazida de etidio (EMA) y la monoazida de propidio (PMA) para determinar su desempeño en la reducción de la señal de falsos positivos en qPCR. PMA pareció brindar una mejor opción para reducir la detección de falsos positivos de ADN en una célula con membrana comprometida.